石正丽团队研究成果在Nature发表：新型冠状病毒宿主可能是蝙蝠

2月3日，《Nature》杂志在线刊出中国科学院武汉病毒研究所石正丽团队针对新型冠状病毒发表的研究论文，题目为《A pneumonia outbreak associated with a new coronavirus of probable bat origin》，翻译过来就是肺炎爆发与可能源于蝙蝠的新型冠状病毒有关。

该论文显示，武汉新型冠状病毒nCoV-2019的序列与一种蝙蝠中的冠状病毒序列一致性高达96%，也就是说，引发武汉新型冠状病毒的宿主可能仍然是蝙蝠。但目前不明确其间是否还有中间宿主。

以下为论文译文：

自18年前SARS爆发以来，大量与严重急性呼吸综合征相关的冠状病毒(SARSr-CoV)在其天然宿主蝙蝠体内被发现。先前的研究表明，其中一些蝙蝠SARSr-CoV具有感染人类的潜力。本文公布了一种新型冠状病毒(2019-nCoV)的鉴定和特征，该病毒在中国武汉引起了急性呼吸综合征的流行。该疫情从2019年12月12日开始，截至2020年1月26日，已造成2050例实验室确诊感染和56例死亡病例。在疫情早期，从5名患者中获得了全长基因组序列。它们之间几乎完全相同，共有79.5%的序列识别到SARS-CoV。此外，还发现2019-nCoV在全基因组水平上与蝙蝠冠状病毒96%相同。对7个保守的非结构蛋白的两两序列分析表明，该病毒属于SARSr-CoV。然后从一名危重病人的支气管肺泡灌洗液中分离出2019-nCoV病毒，该病毒可被几名病人的血清中和。重要的是，我们已经证实这种新的CoV利用与SARS-CoV相同的细胞进入受体ACE2。

在过去的二十年里，冠状病毒已经造成了两次大规模的流行病，分别为非典（SARS）和中东呼吸综合症（MERS）。一般认为，主要存在于蝙蝠体内的SARSr-CoV可能会导致未来疾病暴发。本文研究了中国中部湖北省武汉市发生的一系列不明肺炎疫情。源于一个当地的海鲜市场，截至2020年1月26日，中国感染人数已达2050人，56人死亡，其他11个国家有35人感染。这些病人的典型临床症状是发热、干咳、呼吸困难、头痛和肺炎。疾病发作可导致肺泡损伤引起进行性呼吸衰竭(胸部CT横断面图像观察到)，甚至死亡。临床医师根据临床症状及体温升高、淋巴细胞、白细胞减少(有时为正常)、胸片新肺部浸润、抗生素治疗3天无明显改善等标准确定为病毒性肺炎。大多数早期病例似乎与最初的海鲜市场有接触史，但现在该病已发展为人传人。

来自7位重症肺炎患者的样本被送往WIV实验室进行病原体诊断(Extended Data Table 1)，这里面有6位是海鲜市场卖家或送货商,在疫情爆发之初他们就已重症监护。作为一个CoV实验室，我们首先使用pan-CoV PCR引物测试这些样本，考虑到疫情爆发时间在冬天，地点在一个市场，与非典爆发的环境相同。我们发现5个PCR阳性。采用新一代测序(NGS)的宏基因组学分析方法，从支气管肺泡灌洗液(BALF)中收集样本(WIV04)，以确定潜在的病因。在1038758个总读长或人类基因组筛选获得的1582个总读长中，有1378个(87.1%)序列与SARSr-CoV匹配(图1a)。通过重组和定向PCR，我们获得了29,891- bp的CoV基因组，其与SARS-CoV BJ01 (GenBank登录号AY278488.2)的序列同源性为79.5%。通过重新映射该基因组的总读长，获得了较高的基因组覆盖率(扩展数据图1)。这个序列已提交给GISAID（登录号为EPI_ISL_402124)。根据世卫组织的命名，我们暂定为2019年新型冠状病毒(2019- ncov)。随后，使用NGS和PCR从其他4例患者中获得了4个以上的2019-nCoV全长基因组序列(WIV02、WIV05、WIV06和WIV07) (GISAID登录号为EPI_ISL_402127-402130)，它们之间的相似性均在99.9%以上(Extended Data Table 2)。

病毒基因组由冠状病毒常见的6个主要开放阅读框(ORFs)和一些其他辅助基因组成(图1b)。进一步分析表明，2019-nCoV的部分基因与SARS-CoV的nt序列同源性不足80%。然而，用于CoV物种分类的ORF1ab中的7个保守复制酶结构域，在2019-nCoV和SARS-CoV之间的aa序列相同度为94.6%，这意味着它们属于同一物种(Extended Data Table 3)。

然后，我们从一种蝙蝠冠状病毒(BatCoV RaTG13)中发现了一个短的RdRp区域，这种蝙蝠冠状病毒之前在云南省的犀牛头病毒中检测到过，它对2019-nCoV具有高序列一致性。我们对该RNA样本进行了全长测序(GISAID登陆号为epi_isl_402131)。Simplot分析显示，2019-nCoV在整个基因组中与RaTG13高度相似(图1c)，总基因组序列一致性为96.2%。利用2019-nCoV、RaTG13、SARS-CoV和之前报道的蝙蝠SARSr-CoVs的基因组序列，2019-nCoV的基因组中没有检测到重组事件的证据。全长基因组，RNA依赖性RNA聚合酶（RdRp）基因和S基因序列的系统发育分析均显示，RaTG13是2019-nCoV的最亲近亲戚，与其他SARSr-CoV形成明显的世系（Fig. 1d and Extended Data Figure 2）。受体结合蛋白(S)基因是高度发散到其他CoVs(Extended Data Figure 2),除了对RaTG13有93.1%的nt同源性(Extended Data Figure 3)外，其余所有先前描述的SARSr-CoVs的nt序列同源性都低于75%。2019-nCoV和RaTG13 S基因的S基因比其他SARSrCoVs更长。与SARS-CoV相比，2019-nCoV的主要区别是N末端结构域中的三个短插入和五个受体残基中的四个关键残基发生了变化（Extended Data Figure 3）。是否需要像MERS-CoV一样在2019-nCoV的N末端结构域中进行插入，赋予唾液酸结合活性，还需要进一步研究。与RaTG13的密切系统发育关系为2019-nCoV起源于蝙蝠提供了证据。

我们快速开发了一种基于spike基因受体结合域的qPCR检测方法，该基因是基因组中最可变的区域(图1c)。我们的数据显示，引物可以将2019-nCoV与包括蝙蝠SARSr-CoV WIV1在内的所有其他人类冠状病毒进行区分，其95%与SARS-CoV相同(Extended Data Figure 4a and 4b)。这7名患者中，我们第一次使用qPCR和常规PCR取样时，在6个BALF和5个口服拭子样本中发现2019-nCoV阳性。然而，在第二次采样期间，我们无法在这些患者的口腔拭子、肛门拭子和血液中发现病毒阳性(图2a)。我们必须指出，包括RdRp或E基因在内的其他qPCR靶点可能用于常规检测。根据这些发现，我们推测疾病应该通过气道传播，但如果调查扩大到包括更多的患者，我们不能排除其他的可能性。

为了对2019-nCoV进行血清学检测，我们使用之前开发的蝙蝠SARSr-CoV Rp3核衣壳蛋白(NP)作为IgG和IgM ELISA检测的抗原，该蛋白与2019-nCoV NP具有92%的氨基酸同源性(Extended Data Figure5)，以及除了SARSr-CoV，对其他人类冠状病毒没有交叉反应。作为一个实验室研究，我们只能从7个病毒感染病人那里得到5个血清样本。我们监测了1例患者(ICU-06)在发病后7、8、9和18天的病毒抗体水平(Extended Data Table 2)。IgG和IgM滴度(在最后一天下降)明显上升(图2b)。在第二次调查中，我们在发病后20天左右对7例病毒阳性患者中的5例进行了病毒抗体检测(Extended Data Table 1 and 2)。所有患者的样本，但不包括健康人的样本，均表现出较强的病毒IgG阳性(图2b)。我们还发现3例IgM阳性，表明为急性感染。

然后，我们使用来自ICU-06患者的BALF样本，在Vero和Huh7细胞中成功分离出病毒(命名为2019-nCoV BetaCoV/ Wuhan/WIV04/2019)。培养3天后，观察到明显的细胞致瘤效应(Extended Data Figure 6a and 6b)。通过使用交叉反应性病毒NP抗体免疫荧光显微镜检查（Extended Data Figure 6c and 6d）以及宏基因组测序，在Vero E6细胞中验证了菌株WIV04的身份，其中大部分读长映射到2019-nCoV和qPCR，显示从第1天到第3天病毒载量增加（扩展数据图6e和6f）。在电子显微镜下，被感染细胞的超薄切片中的病毒颗粒显示出典型冠状病毒形态（Extended Data Figure 6g）。为了进一步确认病毒IgG阳性样本的中和活性，我们使用5例IgG阳性患者血清对Vero E6细胞进行了血清中和试验。我们证明，所有样品都能在1:40-1:80的稀释倍数下中和120 TCID50 2019-nCoV。我们还发现，该病毒可以被1:80稀释的马抗SARS-CoV血清(L-F Wang提供)交叉中和，但与SARS-CoV抗体交叉反应的可能性需要用来自人类的抗SARS-CoV血清来确认(扩展数据表4)。

血管紧张素转换酶II (ACE2)被认为是SARS-CoV的细胞受体。为了确定2019-nCoV是否也使用ACE2作为细胞进入受体，我们使用从人类、中国马蹄蝠、果子狸、猪和小鼠中表达或不表达ACE2蛋白的HeLa细胞进行了病毒感染性研究。我们发现,2019-nCoV能够使用除小鼠ACE2以外的所有受体作为表达ACE2的细胞中的进入受体，而不使用不含ACE2的细胞，表明这可能是2019-nCoV的细胞受体（图3）。我们也证明2019-nCoV不使用其他冠状病毒受体,氨肽酶N和二肽基肽酶4(Extended Data Figure 7)。

本研究提供了关于2019-nCoV的第一份详细报告，2019-nCoV可能是导致中国中部城市武汉持续急性呼吸综合征流行的病因。在所有接受检测的患者中观察到的病毒特异性核苷酸阳性和病毒蛋白血清转化为该疾病与该病毒存在之间的联系提供了证据。然而，仍然有许多紧迫的问题需要回答。2019-nCoV与疾病之间的联系还没有被动物实验证明，以严格符合科赫法则。我们还不知道这种病毒在宿主之间的传播规律。而且这种病毒在人与人之间传播的可能性越来越大了。我们将密切监测病毒是否继续演变成具有更强的毒性。由于缺乏特定的治疗方法，并考虑到SARS-CoV与2019-nCoV之间的相关性，一些药物和针对SARS-CoV的临床前疫苗可能可以应用于该病毒。最后，考虑到SARSr-CoV在其自然宿主中的广泛传播，未来的研究应集中于通过更广泛的地理区域积极监测这些病毒。从长远来看，应准备广谱抗病毒药物和疫苗，以应对未来这类病毒群引起的新发传染病。最重要的是，应该严格限制野生动物的驯养和消费。

论文原文，图表，研究方法：

https://www.nature.com/articles/s41586-020-2012-7_reference.pdf

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